Isolierung des Fusionsproteins
Nachdem wir die optimalen Expressionsbedingungen (Temperatur, Induktionszeit) für unser Expressionssystem BL21/PRSET-Insulin bestimmt haben, können wir unter diesen Bedingungen eine Großkultur (z.B. 4x2 Liter) ansetzen und unter Zugabe von IPTG das Fusionsprotein exprimieren.
Aber wie können wir aus dem daraus gewonnenen Zelllysat anschliessend das Fusionsprotein in reiner Form isolieren?
Hier kommt uns ein weiteres Kriterium unseres Fusionsproteins zu Hilfe.
Durch das Einklonieren der Insulin Sequenz in den Expressionsvektor pRSETA kann das folgende Fusionsprotein exprimiert werden:
Dieser sogenannte His-Tag besteht aus einer Nukleotidsequenz, die für sechs Histidine kodiert. Diese Hididine können mit den positiv geladenen Ni-Ionen eines speziellen Säulenmaterials (Ni-NTA) interagieren und somit gebunden werden. Indem man das Lysat mit der Säulenmatrix inkubiert, kann das Fusionsprotein an das Säulenmaterial gebunden werden, während alle anderen Proteine ungebunden im Durchfluss verbleiben. Nach einigen Waschschritten kann somit das Fusionsprotein von allen übrigen Proteinen des Zelllysates getrennt werden. Von der Säule eluiert wird das Fusionsprotein anschliessend mit einem Elutionspuffer, der Imidazol enthält. Imidazol hat eine höhere Affinität zu dem Säulenmaterial und verdrängt dadurch das Fusionsprotein von der Säule.
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| Insulin-Fusionsprotein |
Dieser sogenannte His-Tag besteht aus einer Nukleotidsequenz, die für sechs Histidine kodiert. Diese Hididine können mit den positiv geladenen Ni-Ionen eines speziellen Säulenmaterials (Ni-NTA) interagieren und somit gebunden werden. Indem man das Lysat mit der Säulenmatrix inkubiert, kann das Fusionsprotein an das Säulenmaterial gebunden werden, während alle anderen Proteine ungebunden im Durchfluss verbleiben. Nach einigen Waschschritten kann somit das Fusionsprotein von allen übrigen Proteinen des Zelllysates getrennt werden. Von der Säule eluiert wird das Fusionsprotein anschliessend mit einem Elutionspuffer, der Imidazol enthält. Imidazol hat eine höhere Affinität zu dem Säulenmaterial und verdrängt dadurch das Fusionsprotein von der Säule.
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| Interaktion des His-Tags mit einer Ni-NTA Matrix. Quelle: Chemgapedia |
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| Quelle: Quiagen (modifiziert) |