Nachdem Sie das Prinzip der PCR nun verstanden haben wollen wir diese PCR nun im Serial Cloner simulieren.
Die Auswahl der geeigneten Primer ist keine triviale Angelegenheit, denn die Primer müssen einer Reihe von Anforderungen erfüllen, um eine erfolgreiche Reaktion zu gewährleisten.
Da dies nun zur sehr ins Detail gehen würde, habe ich Ihnen 2 fiktive Primer generiert:
(Laden sie diese Sequenzen herunter, öffnen und speichern Sie diese in Ihrem Serial Cloner!)
Die Abkürzungen fwd. bzw. rev. stehen für den vorwärts laufenden (forward) Primer bzw. rückwärts laufenden (Reverse) Primer.
Vergegenwärtigen Sie sich noch einmal, dass die DNA-Polymerase in 5´-->3´ Richtung arbeitet. Während der Kodierende Strang mit dem ATG startet und durch die Polymerase lediglich nach vorne (forward) verlängert wird, wird der komplementäre Rückwärtsstrang von hinten nach vorne (d.h. vom Stopp Codon zum ATG hin) synthetisiert.
Folglich müssen auch die Primer (d.h. die Replikationsstartstellen) eine 5´-3´Orientierung aufweisen, die durch die Polymerase anschliessend nur noch verlängert wird. Dies bedeutet, dass die zum Insulin Gen homologe Sequenz des Rückwärtsprimers revers komplementär zum kodierenden Strang ist.
Folglich müssen auch die Primer (d.h. die Replikationsstartstellen) eine 5´-3´Orientierung aufweisen, die durch die Polymerase anschliessend nur noch verlängert wird. Dies bedeutet, dass die zum Insulin Gen homologe Sequenz des Rückwärtsprimers revers komplementär zum kodierenden Strang ist.
Der Forward Primer
5´XhoI-Insulin fwd. (5´GATCCTCGAGTTTGTGAACCAACACCTGTGC-3´)
codiert für die XhoI-Restriktionsschnittstelle (CTCGAG), welche sich direkt an die Sequenz der ß-Kette des Insulins anschliesst. Die Signalsequenz wurde aus den besprochenen Gründen eliminiert.
Da er die Sequenz des kodierenden Stranges enthält, bindet er an den komplementären Gegenstrang.
Damit das Restriktionsenzym effizient schneidet, ist es ratsam, dass entsprechende Fragment nicht direkt mit der Schnittstelle enden zu lassen, sondern einen Überhang zu generieren, damit das Enzym an den DNA Strang anheften und die DNA effizient schneiden kann. Zu diesem Zweck beginnt der Primer mit den 4 Nukleotiden GATC, an die sich die Restriktionsschnittstelle des XhoI anschliesst.
Der Reverse Primer
5´EcoRI-Insulin rev.
(5´-GATCGAATTCCTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3´)
dient dazu, den Gegenstrang zu synthetisieren. Die (zur Gensequenz) homologen Bereiche (CTAGTTGCAGTAGTTCTCC) sind somit komplementär zur Sequenz des kodierenden DNA-Stranges. Aufgrund der 5-3´Richtung der DNA Polymerase ist die Sequenz zudem auch revers, d.h. rückwärtslaufend...
Aufgabe 1
In Silico PCR des XhoI-Insulin-EcoRI Inserts
Öffnen Sie für die in Silico PCR das PCR Fenster des Serial Cloners.
Weisen Sie dem Programm nun die Matrix DNA Sequence zu, also die Sequenz, die als Template (Matrize) dienen sollen. Drücken Sie auf OPEN und wählen Sie die Sequenz der Insulin mRNA aus.
In ähnlicher Weise wählen sie nun die Primer aus, die sie zuvor heruntergeladen haben.
Starten Sie jetzt die PCR Simulation (Evaluate PCR). Wenn die Primer passen, wird Ihnen die Länge des erwarteten Fragmentes angezeigt. Wie groß ist das zu erwartende Fragment?
Starten sie nun die PCR (Start PCR) und speichern Sie das PCR Produkt unter (PCR Produkt Insulin) im Serial Cloner ab.
- Drucken Sie nun die Sequenz des PCR Produktes aus!
- Markieren sie von Hand die Restriktionsschnittstellen und wo/wie das Fragment exakt geschnitten wird, wenn es mit den Enzymen XhoI und EcoRI behandelt wird!
- Wie groß ist das PCR Produkt a) vor und b) nach dem Restriktionsverdau ?
(Falls Sie mit einem eigenem Unterrichtsblog arbeiten, fügen sie ein Photo der bearbeiteten Sequenz in Ihren Blog ein.)