Regulation der Genexpression
Bezüglich der Expression eines sogenannten rekombinanten Proteins (d.h. eines Proteins, dessen DNA Sequenz neu rekombiniert wurde (in diesem Fall in einen Vektor ) unterscheidet man zwischen 2 Expressionsformen:
a) konstitutive Expression
b) induzierbare Expression
Bei der konstitutiven Expression wird das Protein kontinuierlich exprimiert. Das Gen steht hierbei unter der Kontrolle eines sogenannten konstitutiven Promotors. Bei der induzierbaren Expression lässt sich die Expression regulieren, kann also kontrolliert werden.
Prokaryotische Gene sind meist in sogenannten Operons organisiert. Ihre Expression kann durch regulatorische Proteine beeinflusst werden. Diese Regulatorproteine binden
an DNA-Bereiche in der Nachbarschaft (meistens
stromaufwärts) eines Gens oder Operons und beeinflussen die
Bindungseigenschaften
der RNA-Polymerase. Der Promotor ist eine Basensequenz, die von der RNA-Polymerase erkannt und gebunden
wird; hier beginnt also die Transkription. Der Operator ist eine Basensequenz, die zwischen Promotor und
den entsprechenden Genen liegt und die einen Repressor binden kann. Wenn ein Repressor an den Operatorbereich
bindet, wird die Transkription durch die RNA-Polymerase verhindert. In Anwesenheit eines Inducers wird dieser vom Repressor gebunden, wodurch sich seine Konformation ändert, und dieser von der DNA abfällt. Die RNA-Polymerase kann nun an den Promotor binden und das Gen transkribieren.
Nahezu alle kommerziell erhältlichen rekombinanten Expressionssysteme sind induzierbar.
Das Expressionssystem pRSET steht unter der Kontrolle des starken T7 Promotors. Damit in den Bakterien die Gene, die unter seiner Kontrolle stehen, transkribiert werden können, muss T7 Polymerase vorhanden sein.
In dem Bakterienstamm BL21 steht das Gen, das für die T7 Polymerase kodiert, unter der Kontrolle des Lac Operators, Unter nicht induzierten Bedingungen kann der Lac Repressor, der durch das Lac I Gen kodiert und konstitutiv exprimiert wird, an diese Operator Sequenz binden. Diese Bindung ist nicht konstant, sondern ähnelt vielmehr einem ständigen Greifen und Loslassen (vgl. Video). Da dieser Repressor jedoch in hoher Anzahl produziert wird, hat die Polymerase kaum eine Möglichkeit an den Promotor zu binden und das T7 Polymerase Gen zu transkribieren. Es wird nur wenig bis keine T7 Polymerase transkribiert. Folglich kann die T7 Polymerase auch kein Insulin-Fusionsprotein transkribieren.
Inducer wie Lactose,
Allactose oder auch synthetische Inducer wie IPTG (Isopropyl β-D-
thiogalactoside) können an den Lac-Repressor binden, wodurch
dieser seine Konformation ändert und seine Affinität zur DNA verliert. Die Operon Sequenz wird konstant frei, die RNA Polymerase kann an den
Promotor binden und das Gen der T7 Polymerase transkribieren. Die entstende mRNA wird an den bakteriellen Ribosomen translatiert und T7 Polymerase wird hergestellt.
Diese kann nun an den T7 Promotor des eingebrachten Vektors binden und das Insulin Fusionsprotein transkribieren.
