In der Laborpraxis wird das PCR Produkt wie beschrieben auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gelstück, das das gewünschte PCR Fragment enthält, wird anschliessend aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Kits aus dem Gel isoliert.
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| Herausschneiden des gewünschten DNA Fragmentes aus dem Gel. (Quelle: Wikipedia) |
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| Gel-Extraktion Kit der Firma Quiagen |
Für das weitere Vorgehen gehen wir nun von folgenden Bedingungen aus:
1) Vektor
Sie haben ein Reaktionsgefäß mit 50 µl (Mikroliter) pRSET. Die Konzentration beträgt 1µg/ µl.
2) Insert
Nach erfolgter PCR haben Sie das PCR Produkt mit Hilfe eines Kits aufgereinigt und die Konzentration bestimmt. Sie haben insgesamt 50 µl mit einer Konzentration von 400 ng/µl
Damit wir das PCR Produkt in den Vektor ligieren können, müssen wir die Enden des PCR Produktes sowie den Vektor erst mit den entsprechenden Enzymen schneiden. Durch diesen Restriktionsverdau werden sogenannte sticky ends (überhängende Enden) sowohl an dem PCR Produkt als auch auf dem Vektor generiert, die exakt aufeinander passen, also "kompatibel" für eine darauffolgende Ligation sind. Eine ausführliche Beschreibung zum Restriktionsverdau finden sie HIER.
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| Durch das Schneiden von Vektor und PCR Produkt mit den gleichen Enzymen passen die Fragmente exakt ineinander |
Die
pipettierten Reaktionsansätze werden anschliessend für 2-5 Stunden bei
37°C inkubiert. Erfahrungsgemäss reicht diese Inkubationszeit bei dieser
Temperatur aus, um die DNA vollständig zu verdauen.
Um spätere Religationen des Vektors zu vermeiden, wird der Plasmidansatz
(und zwar NUR der Plasmid Ansatz!!) anschliessend für eine weitere
Stunde mit einer alkalischen Phosphatase inkubiert. Durch dieses Enzym
werden die Phosphatgruppen an den frei liegenden 5´-Enden des Vektors
dephosphoryliert (d.h. die Phosphatgruppe abgespalten), dh. die nach
nach dem Restriktionsverdau vorliegenden, endständigen Phosphatgruppen
werden abgespalten. Hierdurch kann der Vektor ausschliesslich mit einem
verdauten PCR Produkt ligieren:
Behandlung der Vektor DNA mit alkalischer Phosphatatse
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| Quelle: www.mathehotline.de |
Nach erfolgter Dephosphosphorylierung werden die Ansätze für 20 min. auf 80°C erhitzt um die enthaltenen Enzyme zu inaktivieren. Anschliessend werden Vektor und Insert mit Hilfe eines Kits aufgereinigt und können anschliessend für die Ligation verwendet werden.
Aufgabe 1
Berechnen Sie sowohl für den Vector pRSET als auch für das PCR Produkt die einzusetzenden Mengen in µl.
Ergänzen Sie die fehlenden Volumina DNA, Puffer und Wasser und fügen sie die vollständige Pipettieranweisung ihrem Blog/Arbeitsheft bei.
Ergänzen Sie die fehlenden Volumina DNA, Puffer und Wasser und fügen sie die vollständige Pipettieranweisung ihrem Blog/Arbeitsheft bei.
Gehen sie hierbei von folgendenen Richtlinien aus:
- Sie wollen 5µg Vector bzw. PCR Produkt verdauen
- In einem Doppelverdau setzen sie pro Reaktion 2µl XhoI und 2µl EcoRI ein.
- Damit die Enzyme richtig schneiden können, benötigen diese Enzyme bestimmte Co-Faktoren wie z.B Mg2+ - Ionen. Diese werden in einem Puffer bereitgestellt. Dieser Puffer ist 10-fach konzentriert. Sie müssen diesen Puffer also in dem Reaktionsansatz auf 1/10 verdünnen.
- Einige Enzyme benötigen zudem BSA (bovine serum albumin). Dies ist ein aus dem Serum von Rindern gewonnes Protein, das eine stabilisierende Wirkung erfüllt. Hiervon geben sie pro Ansatz 1µl hinzu.
- Das Gesamtvolumen jedes Reaktionsansatzes soll 50µl betragen. Füllen sie wenn nötig mit H2O auf.
Aufgabe 2
Wievielen Mililitern (ml) entspricht 1µl ?
Aufgabe 3
Welche Konsequenzen hat es, wenn sie anstatt des Vektors das verdaute PCR Produkt (Insert) mit einer Phosphatase behandeln ?