Lektion 15


Wenn es alles funktioniert hat, sollten wir nun den folgenden, generierten Vektor haben:


pRSETA-Insulin w/o Leader



Diesen Vektor werden wir nun in den Bakterienstamm BL21 einbringen. Die Transkriptions-/Translationsmachinerie der Bakterienzelle wird dieses fremde DNA Element wie die eigene DNA behandeln udn die darauf kodierten Proteine exprimieren...



Transformation

"Als Transformation wird in der Molekularbiologie die nicht-virale Übertragung von freier DNA in kompetente Bakterienzellen sowie in Pilze, Algen, Hefen und Pflanzen bezeichnet." (Quelle: Wikipedia)

1 µl des Ligationsansatzes wird dementsprechend verwendet um 50 µl kompetente BL21 E.coli Bakterien zu transformieren. Hierzu wird der 1 µl zu den Bakterien gegeben und der Ansatz 10 min auf Eis inkubiert. Hierbei heftet sich die DNA an die Bakterienwand an. Durch einen anschliessenden Hitzeschock (1 min bei 42°C) öffnen sich die Poren in der Zellwand und die DNA wird ins Zellinnere aufgenommen. Nach einer kurzen Inkubationsphase auf Eis (10 min) gibt man anschliessend  1 ml LB Medium zu den Zellen und inkubiert den Ansatz für 1h bei 37°C. In dieser Zeit kann die durch das Ampicillin-Resistenzgen (ampR) kodierte ß-Lactamase exprimiert werden. ß-Lactamase inaktiviert das Antibiotikum Ampicillin. Bakterien, die ein Ampicillin Resistenz-Gen besitzen bzw. dieses exprimieren, sind fähig auf Ampicillin-haltigen LB-Platten zu wachsen. Sie sind resistent gegen dieses Antibiotikum. 



Ampicillin ist ein halbsynthetisches β-Lactam-Antibiotikum, dessen Synthese über Penicillin erfolgt. Einführung einer polaren Aminogruppe in die Seitenkette des Moleküls ermöglicht die Passage durch wassergefüllte Porenkomplexe (Porine) in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien; damit zeigt Ampicillin Wirksamkeit sowohl gegen grampositive als auch gegen gramnegative Bakterien (Breitbandantibiotikum). Die häufig beobachtete Resistenz von Bakterien gegen Ampicillin (Antibiotika-Resistenz) beruht auf einem Ampicillin-Resistenzgen (Resistenzfaktoren), das auf einem Plasmid lokalisiert ist. Das Produkt dieses Gens, das Enzym β-Lactamase (β-Lactamasen), inaktiviert das Ampicillin durch Spaltung des β-Lactamrings. Plasmid-DNA-Moleküle mit Resistenzgenen sind unentbehrliche Werkzeuge für die Techniken der molekularen Genetik, wo sie als Vektoren zur Klonierung von DNA-Fragmenten dienen. Das Ampicillin-Resistenzgen dient in der Gentechnologie häufig als Indikator, um die Anwesenheit eines Plasmids in der Wirtszelle zu testen (Bakterien sind Ampicillin-resistent)





Ist die einstündige, phänotypische Expression der Ampicillin Resistenz abgeschlossen, werden die Zellen kurz abzentrifugiert und anschliessend auf LB-amp Platten ausplattiert. 
LB-amp Platten sind Petrischalen aus Kunststoff, die ein für das Bakterienwachstum optimiertes Nährmedium enthalten. Zudem enthält das LB-amp Medium das Antibiotikum Ampicilin (amp), das auf nicht-transformierte Bakterienzellen toxisch wirkt.

Quelle: Wikipedia


Die Platten werden anschliessend für ca. 24h in einem Brutschrank bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen können sich die transformierten Zellen vermehren. Die Generationszeit des Bakteriums E.coli  beträgt bei bei optimalen Wachstumsbedingungen im Durchschnitt 20 min, d.h. unter optimalen Bedingungen teilt sich eine E.coli Zelle in 20 min. Aus einer einzigen transformierten Zellen entstehen somit durch Teilung (Mitose) innerhalb weniger Stunden mehrere tausend Zellen, die sogenannte Kolonien ausbilden. Alle Zellen einer Kolonie sind genetisch identisch. Genetisch identische Organismen bezeichnet man als Klone.


Agarplatte mit  Transformationsklonen (Quelle: www.dguv.de)





Da die Agarplatte das Antibiotikum Ampicillin enthält, werden sich auf der Platte nur diejenigen Bakterienzellen vermehren, die das Ampicillin-Resistenzgen besitzen, das auf dem Plasmid kodiert ist. Auf diese Weise kann man also auf positive Transformanten (Bakterien, die das Plasmid erfolgreich aufgenommen haben) selektieren.





Exponentielles Wachstum

    

Hier ist das expontentielle Wachstum eindrücklich erklärt. Beeindruckend, dass eine Bakterienkultur die anfangs aus lediglich einer E.coli Zelle besteht, unter optimalen Bedingungen nach 10 h bereits 1 000 000  (1Mio) Zellen erreicht hat. 

Exponentielles Wachstum einer E. coli Kultur (Quelle: http://www.u-helmich.de/bio/oek/oek02/demoek1.html)



Das folgende Video fasst noch einmal alle bisherigen Schritte zusammen...





In der nächsten Lektion werden wir uns jetzt mit der Proteinexpression befassen.....