Klonierungssoftware
In der modernen Wissenschaft kommt heute vielfach Klonierungssoftware zum Einsatz, die dabei hilft, DNA und Proteinsequenzen zu organisieren und konkrete Klonierungsvorhaben in silico (d.h. am Computer) zu planen. Die meisten dieser leistungsstarken Softwareprogramme wie beispielsweise DNAstar oder VectorNTI sind kostenpflichtig und eine Lizenz kostet meist über 1000 Sfr. Es gibt jedoch auch kostenlose Klonierungsprogramme wie den auch im Laboralltag an Universitäten zum Einsatz kommenden Serial Cloner.
Aufgabe 1
Installieren sie bitte das Programm SerialCloner auf Ihrem Computer !
Das Programm ist auf Englisch, aber keine Sorge! Die Grundfunktionen dieses Programms werden sie nach dieser Lektion beherrschen.
Nachdem sie das Programm installiert haben, öffnen sie bitte das folgende Dokument:
Am Ende dieses Dokumentes finden sie die Sequenz des humanen Insulin Gens. Die Nummern am Beginn jeder Zeile beziehen sich auf das jeweils erste Nukleotid in jeder Zeile und dienen der Orientierung in der Sequenz.
Im Folgenden wollen wir die Sequenz nun in unser Klonierungsprogramm importieren.
Da uns die Nummern am Beginn jeder Zeile stören (sie können vom Serial Cloner nicht gelesen werden), gehen sie bitte wieder zum Beginn dieses Dokumentes. Unterhalb der Überschrift finden sie einen Link zu einem FASTA Dokument. Klicken sie hier nun drauf. In einem sich öffnenden Tab wird Ihnen die Rohsequenz des Insulin Gens angezeigt.
Kopieren Sie diese vollständige DNA Sequenz beginnend mit CTC.
Öffnen Sie nun den Serial Cloner. Drücken Sie auf "New sequence Window" und fügen Sie die kopierte Sequenz nun in das nummerierte Fenster ein (paste). Speichern Sie das Dokument unter "Humanes Insulin Gen, cds" ab. Am besten legen sie einen speziellen Ordner für diese und folgende Sequenzen an, damit sie den Überblick behalten.
Jetzt kommen wir zu einem fortgeschrittenen Problem:
In den vorherigen Lektionen haben wir erfahren, dass das Insulinpreproprotein aus 110 aa besteht. Nach dem genetischen Code bräuchte man also nur 330 Nukleotide um dieses Protein zu codieren. Die hier gezeigte Sequenz besteht jedoch aus 4044 Nukleotiden! Dies hängt mit der sogenannten Exon-Intron Struktur eukaryotischer Gene zusammen:
Die codierenden Bereiche der eukaryontischen DNA (Exons) sind immer wieder durch so genannte Introns
unterbrochen. Diese nicht-codierenden Bereiche werden zunächst auch
transkribiert, d.h. in mRNA
übersetzt, müssen aber später aus der Prä-mRNA durch
RNA-Spleißen wieder entfernt werden, bevor diese mRNA als reife mRNA vom
Kern
ins Cytoplasma der Zelle transportiert wird. Die Anzahl an Introns variiert beträchtlich; während manche Gene über 50 Introns haben, haben andere Gene gar
keine.
Quelle: Chemgapedia
Aufgabe 2
Wir wollen die in den Serial Cloner eingefügte Sequenz jetzt etwas näher analysieren:
Wir wissen bereits, dass das Insulin Preproprotein aus einer Signalsequenz, einer A-Kette, einer B-Kette sowie einer posttranslational abgespaltenen C-Kette besteht. Des weiteren wissen wir, dass die DNA Sequenz durch nicht-codierende Introns unterbrochen wird. Die entsprechenden Sequenzabschnitte wollen wir nun in unserer Sequenz exakt markieren.
Das Datenblatt zum Human Insulin Gene, cds gibt darüber Auskunft, welche Bereiche Teil des Introns, der Exons, sowie des Signalpeptides sind. Die jeweiligen Stellen sind angegeben.
 | ||||
| NCBI- Human Insulin Gene, cds |
Markieren sie nun die entsprechenden Bereiche in ihrer Serial Cloner Sequenz.
Markieren sie exakt die entsprechenden Bereiche in der Sequenz. Orientieren sie sich dabei an den angebenen Werten in dem Datenblatt sowie den angebenen Cursor-Positionen rechts oben in dem Sequenzfenster. Betätigen sie anschliessend bei gedrückter Control-Taste die Maustaste (Mac) bzw. drücken sie die rechte Maustaste (bei Windows). Es öffnet sich ein Fenster. Drücken Sie auf "Create new feature". Nun können sie dem Sequenzabschnitt einen Namen z.B. Signal Peptide, Exon 1 oder Intron geben und dem jeweiligen Element eine andere Farbe geben, um es anschliessend besser finden zu können.
Da Bakteriengenome keine Intronsequenzen besitzen und ihnen auch die fürs das Spleissen notwendigen Enzyme fehlen, sollten wir eine durchgängige Exon Sequenz des Insulin Gens in den Expressionsvektor klonieren.
Diese Sequenz kann man leicht finden, indem man nach der fertig prozessierten mRNA Sequenz recherchiert:
mRNA Sequence human Insulin
Hier sehen sie auch die typischen Elemente eines Gens:
Dies
beginnt mit einem, für die Aminosäure Methionin codierenden Start Codon
(ATG) und endet mit einem Stopp Codon (TAA, TAG, TGA) bzw. (UAA, UAG,
UGA).
Kopieren Sie auch diese Sequenz in ein separates Serial Cloner Dokument und benennen Sie dieses Dokument mit "Humane Insulin - mRNA" !
Im der nächsten Lektion wollen wir uns den Vektor (Plasmid) etwas genauer anschauen, in den wir die Insulin-codierende Sequenz hinein klonieren wollen.....