Im folgenden wollen wir uns nun mit dem Plasmid (Vektor) beschäftigen, der in dieser Klonierung eingesetzt wird.
Wissen sie noch, was ein Vector (Plasmid) ist?
Falls nicht, verschaffen sie sich noch einmal einen gesunden Überblick in Ihrem Lehrbuch oder diesem Link !
Plasmide werden von Biotechnologie Firmen in unzähligen Variationen mit speziellen Eigenschaften angeboten.
Für unsere Klonierung wollen wir den Vektor pRSET der Firma LifeTechnologies (eine der weltweit größten Biotechnologie Firmen) nutzen:
Wissen sie noch, was ein Vector (Plasmid) ist?
Falls nicht, verschaffen sie sich noch einmal einen gesunden Überblick in Ihrem Lehrbuch oder diesem Link !
Plasmide werden von Biotechnologie Firmen in unzähligen Variationen mit speziellen Eigenschaften angeboten.
Für unsere Klonierung wollen wir den Vektor pRSET der Firma LifeTechnologies (eine der weltweit größten Biotechnologie Firmen) nutzen:
Diesen Vektor wollen wir uns nun einmal etwas genauer anschauen:
Dokumentation pRSET ABC
Wie auf der Plasmid Karte zu erkennen ist, ist der Plasmid durch verschiedene Elemente charakterisiert.
Aufgabe 1
Recherchieren sie in der Dokumentation, welche Funktion die verschiedenen Elemente ausüben (Seite 20/21). Fassen Sie die Funktionen tabellarisch zusammen. Notieren Sie sich eventuelle Unklarheiten, damit wir diese im Plenum besprechen können.
Das Verständnis der Funktion dieser Elemente ist essentiell und
HOCH PRÜFUNGSRELEVANT ! Gehen Sie sicher, dass sie diesen Teil wirklich verstanden haben !
Ein wichtiges Element eines jeden Vektors stellt die Multiple Cloning Site dar, in der verschiedene Restriktions-schnittstellen (Erkennungsstellen für Restriktions-enzyme) enthalten sind. Restriktionsschnittstellen sind spezifische Sequenzen, die von Restriktionsenzymen (sog. Restriktions-endonukleasen) erkannt werden.
Restriktionsenzyme bzw. Restriktionsendonukleasen (REN) sind kleine Proteine, die spezielle DNA-Sequenzen erkennen und dort gezielt schneiden. Sie werden auch als molekulares Schneidewerkzeug bezeichnet. Die Antagonisten der Restriktionsenzyme sind die sog. Ligasen.
Diese Restriktionsschnittstellen dienen dazu, ein beliebiges Insert (in unserem Fall das Insulin Gen) genau an dieser Stelle passgenau in die Multiple Cloning Site dieses Vektors zu integrieren. Damit dies gelingt, müssen diese Schnittschnellen sowohl auf dem Plasmid (MCS) als auch an den Enden des zu inserierenden Gens vorhanden sein.
Indem sowohl der Vektor als auch das Insert mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten werden, Ihre Enden somit passgenau geschnitten werden, können sie in einem darauffolgenden Schritt zusammengeschweisst, oder wie der Genetiker sagt, legiert werden.
Restriktionsenzyme bzw. Restriktionsendonukleasen (REN) sind kleine Proteine, die spezielle DNA-Sequenzen erkennen und dort gezielt schneiden. Sie werden auch als molekulares Schneidewerkzeug bezeichnet. Die Antagonisten der Restriktionsenzyme sind die sog. Ligasen.
Diese Restriktionsschnittstellen dienen dazu, ein beliebiges Insert (in unserem Fall das Insulin Gen) genau an dieser Stelle passgenau in die Multiple Cloning Site dieses Vektors zu integrieren. Damit dies gelingt, müssen diese Schnittschnellen sowohl auf dem Plasmid (MCS) als auch an den Enden des zu inserierenden Gens vorhanden sein.
Indem sowohl der Vektor als auch das Insert mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten werden, Ihre Enden somit passgenau geschnitten werden, können sie in einem darauffolgenden Schritt zusammengeschweisst, oder wie der Genetiker sagt, legiert werden.
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| Quelle: Wikipedia |
Aufgabe 2
Notieren Sie die Restriktionsenzyme, die in der Multiple Cloning Site des pRSET Vektors enthalten sind, und für die Integration des Insulin Gens genutzt werden könnten.
Notieren sie die Erkennungssequenz der Enzyme XhoI und EcoRI sowie das exakte Schnittmuster. Diese Schnittstellen werden wir für unsere Klonierung nutzen.
Im Serial Cloner finden sie unter Restriction eine "Enzyme Library", die alle bekannten Restriktionsenzyme enthält.
Hier finden Sie die Erkennungssequenzen sowie das exakte Schnittmuster des jeweiligen Enzyms.
Aufgabe 3
Kopieren Sie die Sequenz des Vectors pRSET A und legen sie damit ein neues File in Serial Cloner an. Benennen Sie das File entsprechend "pRSET A" .
Markieren und benennen Sie in der gespeicherten Sequenz die folgenden Sequenzabschnitte mit unterschiedlichen Farben:
Die Plasmid Übersicht auf Seite 11 gibt Aufschluss über die entsprechenden Sequenzabschnitte.
Tip:
- Restriktionsschnittstellen XhoI und EcoRI
- Promotor T7
- ATG
- 6xHis Tag
- Xpress Epitope mit EK cleavage Site
- Ampicillin Resistenzkassette
Die Plasmid Übersicht auf Seite 11 gibt Aufschluss über die entsprechenden Sequenzabschnitte.
Serial Cloner findet automatisch Restriktionsschnittstellen.
Drücken Sie auf Edit - Find - Site und wählen sie das entsprechende Enzym aus. Serial Cloner zeigt Ihnen anschliessend die Position der entsprechenden Schnittstelle.