Wenn die PCR funktioniert hat, sollten wir anschliessend in unserem PCR-Tube ca. 50 µl Flüssigkeit haben, in denen unser gewünschtes Produkt XhoI-Insulin-EcoRI in recht konzentrierter Form enthalten ist. Aber wie können wir prüfen, ob die Reaktion überhaupt funktoniert hat udn tatsächlich ein Produkt in ausreichender Konzentration hervorgebracht hat? Und wie können wir aus dem Ansatz die Primer, Polymerase, übrigen dNTPS und vor allem die Template DNA entfernen?
Hierzu werden wir nun eine wichtige Methode der Biochemie kennenlernen.
Die Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose - Gelelektrophorese ist eine der wichtigsten Methoden in der Biochemie. Mit Ihrer Hilfe können sowohl DNA als auch RNA Fragmente der Größe nach aufgetrennt werden.
Auf diese Weise kann man also ein Gemisch aus verschiedenen Komponenten auftrennen und eine bestimmte Komponente X (z.B. ein bestimmtes DNA Fragment) isolieren.
Technisch beruht die Agarose Gelelektrophorese a) auf dem durch die Agarose Moleküle gebildeten Maschennetzwerk, dessen Porengröße von der Agarose-Konzentration abhängt, und zum anderen vom Wanderungungsverhalten der negativ geladenen DNA in einem elektrischen Feld.
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| Quelle: www.bioc.uzh.ch |
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| Quelle: www.bioc.uzh.ch |
Die Methode ist auf den folgenden Seiten gut beschrieben:
Agarose Gel
Uni ZH- Agarose Gel
Gelelektrophorese
Chemgapedia - Gelelektrophorese (Seite 12-15)
Sichtbar macht man die DNA hierbei durch den Zusatz fluoreszierender Substanzen, wie zum Beispiel Ethidiumbromid (serh giftig!), zu der Gellösung.
Ethidiumbromid, 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromid,
ein organischer Farbstoff, der aufgrund seiner planaren Struktur leicht
in die DNA interkalieren kann. Das interkalierte EtBr kann durch Licht der Wellenlänge 200-300nm (UV-Licht) angeregt werden und emitiert Licht im orange-roten
Bereich (590 nm). Da durch die Bindung eine Fluoreszenzverstärkung
resultiert, ist die Färbung der Nucleinsäuren auch in Gegenwart des
freien E. gut sichtbar. Routinemäßig wird E. dem Agarosegel und dem
Laufpuffer zugesetzt, wodurch eine anschließende Färbung nicht
erforderlich ist und man darüber hinaus die Wanderung der Nucleinsäuren
in einfacher Weise zeitlich verfolgen kann. Das E.-Kation ist für die
Fluoreszenz verantwortlich und wandert während der Elektrophorese zur
Kathode. Die Färbung mit E. in Agarose-Gelen ermöglicht den Nachweis von
10-20 ng doppelsträngiger DNA. Die Mobilität der DNA wird durch die
Interkalation von E. um etwa 15% reduziert. Auch einzelsträngige DNA und
RNA interagiert mit E., allerdings sind die Wechselwirkungen deutlich
schwächer. E. ist wegen seiner interkalierenden Wirkung ein starkes
Mutagen, so dass beim Umgang große Sorgfalt geboten ist.
Quelle: www.spektrum.de
EtBr-Interkalation zwischen 2 A-T Baasenpaare in einer doppelsträngigen DNA:
Aufgabe 1
In den folgenden Abbildungen sind Absorptionsspektren aufgelistet.
1. Erklären sie mit eigenen Worten, was man unter einem Absorptionsspektrum versteht.
2. Welches der gezeigten Absorptionsspektren ist das Absoprtionsspektrum des Ethidiumbromids ? Erläutern sie kurz ihre Entscheidung!
A)
B)
C)
Aufgabe 2
Nachdem Sie die PCR durchgeführt haben, trennen Sie ein kleines Aliquot des PCR Ansatzes auf einem 2%igen Agarosegel auf.
Als Referenz tragen sie in eine zweite Tasche 5 µl des DNA-Markers "GelPilot 100bp plus Ladder" auf.
DNA Marker sind Lösungen die eine definierte Zusammensetzung unterschiedlich großer DNA Fragmente beinhalten. Ein Vergleich der beobachteten Bande mit dem Marker lässt später Rückschlüsse auf die Reinheit, Identität bzw. den Erfolg einer PCR zu.
Das Arbeitsblatt zu dieser Aufgabe können Sie hier herunterladen.
Zeichnen sie in dem Kästchen ein, wo Sie bei der erhaltenen PCR-Probe Bande(n) erwarten würden und erläutern sie dies kurz.
Aufgabe 3
Die folgende Skizze skizziert den Versuchsaufbau einer Elektrophorese:
In die Tasche A geben sie ihr erhaltenes PCR Produkt. In Tasche B eine NaCl Lösung und in Tasche C Glycerin.
Beschriften sie die Pole mit den entsprechenden Begriffen ( + Pol, - Pol, Anode, Kathode) und markieren sie mit Pfeilen, welche Teilchen sich beim Anlegen einer elektrischen Spannung aus welchen Proben in welche Richtung bewegen .
Das Bild können sie HIER herunterladen.
EtBr-Interkalation zwischen 2 A-T Baasenpaare in einer doppelsträngigen DNA:
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Quelle: Wikipedia Commons by Bjh21 |
Aufgrund der hohen Giftigkeit von Ethidiumbromid werden heute zunehmend weniger gesundheitsschädliche Alternativen wie z.B. Midori-Green im Laboralltag eingesetzt.
Aufgabe 1
In den folgenden Abbildungen sind Absorptionsspektren aufgelistet.
1. Erklären sie mit eigenen Worten, was man unter einem Absorptionsspektrum versteht.
2. Welches der gezeigten Absorptionsspektren ist das Absoprtionsspektrum des Ethidiumbromids ? Erläutern sie kurz ihre Entscheidung!
A)
B)
C)
Aufgabe 2
Nachdem Sie die PCR durchgeführt haben, trennen Sie ein kleines Aliquot des PCR Ansatzes auf einem 2%igen Agarosegel auf.
Als Referenz tragen sie in eine zweite Tasche 5 µl des DNA-Markers "GelPilot 100bp plus Ladder" auf.
DNA Marker sind Lösungen die eine definierte Zusammensetzung unterschiedlich großer DNA Fragmente beinhalten. Ein Vergleich der beobachteten Bande mit dem Marker lässt später Rückschlüsse auf die Reinheit, Identität bzw. den Erfolg einer PCR zu.
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| Quelle: Qiagen |
Das Arbeitsblatt zu dieser Aufgabe können Sie hier herunterladen.
Zeichnen sie in dem Kästchen ein, wo Sie bei der erhaltenen PCR-Probe Bande(n) erwarten würden und erläutern sie dies kurz.
Aufgabe 3
Die folgende Skizze skizziert den Versuchsaufbau einer Elektrophorese:
In die Tasche A geben sie ihr erhaltenes PCR Produkt. In Tasche B eine NaCl Lösung und in Tasche C Glycerin.
Beschriften sie die Pole mit den entsprechenden Begriffen ( + Pol, - Pol, Anode, Kathode) und markieren sie mit Pfeilen, welche Teilchen sich beim Anlegen einer elektrischen Spannung aus welchen Proben in welche Richtung bewegen .
Das Bild können sie HIER herunterladen.