Lösungen

Lektion 1

• Gen
• Aminosäure
• Protein
• DNA
• Transkription
• mRNA
• Translation

Lektion 2



Aufgabe 1


A) Lewis Formel :          C6H12O6     

B) 

Monosaccharid, Hexose (C6),
Aldose (endständige Adehydgruppe)


C)

Aufgabe 2


A)  ATP


B) 

c) 
Glykolyse, Citrat-(Krebs-) Zyklus,  Oxidative Phosphorylierung

D) 6 Mol


E)  Das Mol (Einheitenzeichen: mol) ist die Basiseinheit der Stoffmenge. Sie dient der Mengenangabe bei chemischen Reaktionen.

Ein Mol enthält etwa 6,022 x 10²³ Teilchen. Diese Zahl ist so definiert, dass 12g des Kohlenstoff  Isotops C-12 genau einem Mol entsprechen. Somit enthält 1 Mol Glukose  6,022 x 10²³ Glukosemoleküle.

Das Molekulargewicht von Glukose (C6H12O6) beträgt   (6x12) + (12x1) + (6x16) = 72 +12 + 96 = 180 g/mol  

Somit wiegt 1 Mol Glukose 180 Gramm.

Aufgabe 3

 Lektion 3



Aufgabe 1

Autor: Sanger,F.

Titel: Chemistry of insulin; determination of the structure of insulin opens the way to greater understanding of life processes

Journal: Science (1959)

--> Frederick Sanger


Aufgabe 2

Insulin preproprotein [Homo sapiens] 
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGG GPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

- besteht aus 110 Aminosäuren
- die ersten 5 Aminosäuren kodieren für Methionin, Alanin, Lysin, Tryptophan, Methionin



Aufgabe 3

Lektion 4



Aufgabe 1

- Alpha Helix
- Beta Faltblatt

- Disulfidbrücken können nur Aminosäuren ausbilden, deren Säurerest Schwefel beinhaltet. Es gibt 2 Aminosäuren die Schwefel beinhalten: Methionin und Cystein

Lektion 5



Aufgabe 1

A)  

Ein Gen ist ein bestimmter Abschnitt auf der DNA, der für ein bestimmtes Protein bzw. Polypeptid (Ein-Gen-ein-Protein-Hypothese) oder ein für den Zellstoffwechsel benötigtes RNA-Molekül codiert.

B) 

A,T,G,und C stehen für die 4 Nukleotide. Ein Nukleotid ist ein Grundbaustein von Nukleinsäuren, also Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA). Es ist ein Molekül mit einem Phosphat-, einem Zucker- und einem Basen­bestandteil. Die Buchstaben stehen jeweils für die Nukleobasen Adenin (A), Thymin (T). Cytosin (C), Guanin (G) . Sie sind Bestandteile der Nukleotide.

C) 333 Baasenpaare (bp)

D) atg gcc ctg tgg atg cgc ctc ctg ccc ctg

E)  N-      M    A    L   W   M   R    L    L   P    L         -C

F)  Tatsächliche Sequenz:

      N-      M    A    L   W   M   R    L    L   P    L        -C

      Sequenz stimmt überein! 

Lektion 6



Aufgabe 1

Bakterien sind Prokaryoten. Hefen dagegen sind Eukaryoten.

Bakterien besitzen keinen Zellkern und auch keine typisch eukaryotischen Organellen wie das ER oder den Golgi Apparat.

Ist von einem Protein bekannt, dass es in einem speziellen Organell, z.B. dem ER oder aber dem Golgi Apparat, posttranslational modifiziert (z.B. glykosyliert, gefaltet oder gespalten) wird, sollte man ein eukaryotisches Expressionssystem (Hefen, Insektenzellen) vorziehen.

Aufgabe 2

Das Leader Peptid dient dazu, das translatierte Insulin in das endoplasmatische Retikulum zu schleusen, wo es weiter prozessiert wird. Da Bakterien kein ER besitzen, macht es auch keinen Sinn, dieses Signalpetid zu exprimieren.

Lektion 7




Aufgabe 1

Concept Map - Klonierung

Lektion 8



Aufgabe 1 + 2

Serial Cloner File -  Humanes Insulin, cds



Aufgabe 3

Serial Cloner File - Humanes Insulin, mRNA

Lektion 9



Aufgabe 1 + 3


Serial Cloner Cloner File -  pRSET A



Aufgabe 2

BamH I     
       

Sac I
Bgl II
Pst I
Pvu II
Kpn I
Nco I

BstB I
Hind III

Lektion 10

Aufgabe 2

• Template DNA  

        --> DNA Matrize

• Primer  (fwd. + rev. Primer   

      --> Startstücke für die DNA Polymerase

• dNTPs                

      --> DNA Bausteine

(Polymerase heftet dNMPs (Monophosphate) an den neu entstehenden DNA Strang, wobei Pyrophosphat (PPi) freigesetzt wird:  dNMP + PPi = dNTP )

• Polymerase Puffer   

      --> ideale Pufferbedingungen für die Polymerase (enthält z.B. Mg2+ Ionen  --> Cofaktor der Polymerase)

• DNA-Polymerase   

  --> Enzym, das das zum Nukleotid der Matrix komplementäre Nukleotid an den Primer bzw. die wachsene Kette anheftet und die Phosphodiesterbindung herstellt.

Aufgabe 3

Aufgabe 4

HIER können sie sich die Lösung als PDF herunterladen.

Mindestens 2 Zyklen sind erforderlich um mindestens 1 vollständiges Insert XhoI-Insulin-EcoRI zu erhalten (siehe Pfeile).

Lektion 11



Aufgabe 1


Serial Cloner File - PCR Produkt Insulin


Das PCR Produkt ist 281 bps lang.





GATCCTCGAGTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGC
AGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGGAATTCGAT










Nach dem Restriktionsverdau mit XhoI und EcoRI ist das Fragment 267 bp lang.

Lektion 12



Aufgabe 1

1) Absorptionsspektrum

Wird ein Atom oder Molekül mit weißem Lich (das alle Wellenlängen enthält) bestrahlt, so werden die Photonen absorbiert, d.h. die in den Photonen enthaltene Energie wird genutzt um  Elektronen in den Atomhüllen der bestrahlten Atome auf  energetisch höhere  Schalen anzuheben. Hierbei handelt es sich um scharf definierte Energiebeträge und damit Wellenlängen.  Licht dieser Wellenlängen wird beim Durchtritt durch das Atom somit aus der weißen Strahlung abgefangen (absorbiert), so dass es in dem Lichtspektrum, das die Probe durchstrahlt, anschliessend (zum Teil) fehlt. Seine Intensität nimmt ab. Ein Absorptionsspektrum zeigt, welche Wellenlängen am meisten "abgefangen", also absorbiert. werden. Fallen die angehobenen Elektronen auf eine energetisch niedrigere Schale zurück, wird die überflüssige Energie in Form von Licht abgegeben, man spricht dann von einem Emissionsspektrum. Die beobachteten Absorptions- und Emissionsspektren sind charakteristisch für die Art der Materie, die die Strahlung durchquert. Deshalb ist die Spektroskopie in verschiedenen Wellenlängenbereichen, auch mit ultraviolettem oder infrarotem Licht, eine wichtige Methode zur Analyse von Stoffen.

2) Bei Abbildung 2 handelt es sich um das Absorbtionsspektrum des Ethidiumbromids, das durch UV Licht (200nm-300nm) angeregt werden kann, d.h. in diesem Bereich hat es sein Absorptionsmaximum.

Aufgabe 2

Das PCR Produkt ist 281 bp lang. Deshalb sollte leicht unterhalb der Höhe der 300 bp Markerbande eine Bande auftauchen, die dem PCR Produkt entspricht.  Nicht eingebaute Primer und sich eventuell gebildetete Primerdimere sollten unterhalb der 100 bp Marke als Schmier zu erkennen sein. Da man in der PCR nur sehr wenig Template DNA (Matrize) einsetzt, ist diese aufgrund der zu geringen Konzentration auf dem Agarose Gel nicht zu sehen.

Lösung: Agarose-Gel des PCR Produktes

Aufgabe 3

Lösung Gelelektrophorese

Lektion 13




Aufgabe 1

Aufgabe 2

1 µl entspricht 10^-6 Litern (1 Millionstel Liter).

1 ml entspricht 10^-3 Litern (1 Tausendstel Liter).

Somit gilt:

1 µl   =  10^-3 ml (1 Tausendstel Mililiter)

Aufgabe 3

Wenn Sie anstatt des Vektors das Insert dephosphorylieren, wird hierdurch die Phosphatgruppe am 5´-Ende des Insert Fragmentes entfernt. Hierdurch kann keine Phosphodiesterbindung mehr mit dem Vektor geknüpft werden. Stattdessen führt die ausbleibende Dephosphorylierung des Vektors zu einer hohen Religationsfrequenz, die jedoch ausschliesslich in falschpositiven Transformanten resultieren wird. Durch dieses Malheur würde somit die ganze Klonierung scheitern.

Lektion 14



Serial Cloner File - pRSET-Insulin

Das Fusionsprotein besteht aus 125 Aminosäuren.

Lektion 17




Aufgabe 1 

IPTG muss man  250 fach verdünnen.
Kultur: V = 200 ml

200 ml/250 = 0,8 ml IPTG


Aufgabe 2 

Von der unverdünnten Probe 1 (vor Induktion) entnehmen sie 125 µl udn überführen diese in ein Reaktionsgefäss. Von der induzierten Probe 2 entnehmen sie 263 µl (direkt aus der Küvette, da sie ja auch diese gemessen haben) udn überführen diese ebenfalls in ein separates Reaktionsgefäss.  Tarieren sie beide Reaktionsgefäße durch Zugabe von Medium grob aus, damit es beim anschliessenden Zentrifugieren nicht zu Ungleichgewichten und damit einer Beschädigung der Zentrifuge kommt. Zentrifugieren sie die Zellen kurz (!) bei voller Geschwindigkeit (full speed)  ab (Nicht länger als 30 sec, sondern platzen die Zellen durch die hohe Zentrifugalkraft).

Kippen Sie den Überstand vollständig ab und resuspendieren Sie die Pellets in jeweils 20 µl Probenpuffer. Erhitzen Sie die Proben 5 Minuten bei 95°C.  In dem Probenpuffer sind SDS und ß-Mercaptoethanol enthalten. Diese entfalten die in der Probe enthaltenen Proteine und neutralisieren die Eigenladung der enthaltenen Proteine, so dass diese  bei der anschliessenden Elektrophorese nur nach Ihrer Größe aufgetrennt werden. Nach der Inkubation bei 95°C können die Proben auf ein SDS-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt werden.