Nachdem Vektor und PCR Produkt enzymatisch verdaut wurden und der Vektor anschliessend dephosphoryliert wurde, kann schliesslich die Ligation angesetzt werden.
Unter Ligation versteht man in der Molekularbiologie die enzymkatalysierte Verknüpfung zweier DNA- oder RNA-Segmente an ihren Enden. Dabei wird das 3'-Hydroxy-Ende mit dem 5'-Phosphat-Ende der Nukleinsäurensegmente mit Hilfe des Enzyms Ligase durch Ausbildung einer Phosphodiesterbindung verbunden.
Für die Ligation werden unter geeigneten Pufferbedingungen verdauter Vektor und verdautes Insert in Anwesenheit einer Ligase bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Ligase knüpft dabei Phosphodiesterverbindungen zwischen der Hydroxygruppe des dephosphorylierten Vektors und der Phosphatgruppe des verdauten PCR Produktes.
Unter Ligation versteht man in der Molekularbiologie die enzymkatalysierte Verknüpfung zweier DNA- oder RNA-Segmente an ihren Enden. Dabei wird das 3'-Hydroxy-Ende mit dem 5'-Phosphat-Ende der Nukleinsäurensegmente mit Hilfe des Enzyms Ligase durch Ausbildung einer Phosphodiesterbindung verbunden.
Für die Ligation werden unter geeigneten Pufferbedingungen verdauter Vektor und verdautes Insert in Anwesenheit einer Ligase bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Ligase knüpft dabei Phosphodiesterverbindungen zwischen der Hydroxygruppe des dephosphorylierten Vektors und der Phosphatgruppe des verdauten PCR Produktes.
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| Quelle: Wikipedia |
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| Quelle: Chemgapedia |
Aufgabe 1
Erstellen Sie mit Serial Cloner ein neues Dokument und versuchen sie die Sequenz des ligierten Vektors pRSET-Insulin zu erstellen.
Durch die Ligation werden die entsprechenden Restriktionsschnittstellen wieder hergestellt. Sie müssen also lediglich auf dem Plasmid den Bereich zwischen den Restriktionsschnittstellen durch das PCR Produkt ersetzen. Hierzu empfielt es sich, die Restriktionsschnittschnittstellen andersfarbig zu markieren !
Arbeiten sie präzise ! Wenn sie auch nur ein Nukleotid vergessen, erhalten sie einen sogenannten frame shift, der die gesamte Sequenz aus dem Takt bringt und somit nur noch Nonsens liefert.
Aufgabe 2
Nachdem Sie nun den Vector pRSET-Insulin in silico konstruiert haben, sollen sie nun überprüfen, ob sie alles richtig gemacht haben:
Öffnen Sie das soeben generierte File pRSET-Insulin. Drücken sie nun auf FIND (unten) udn anschliessend auf ORF !
Das Programm zeigt Ihnen nun alle offenen Leseraster an, also alle durchgehenden Sequenzen im Vektor, die mit einem Start Codon (ATG) beginnen und mit einem Stopp Codon (TAA, TAG) enden.
Klicken Sie sich durch die angezeigten ORFs, bis sie ein ORF erhalten, dass das inserierte PCR Produkt beeinhaltet:
- Ist das gesamte PCR Insert enthalten?
- Sind auch die N-terminalen Fusionselemente (HIS TAG, XPRESS Epitope enthalten ?
Wenn dem so ist, sieht es schon mal gut aus!
Kopieren Sie nun die Aminosäuresäuresequenz dieses Open reading frames in Ihr Lernjournal. Benennen und markieren Sie mit unterschiedlichen Farben die jeweiligen Bereiche des Fusionsproteins.
Aus wievielen Aminosäuren besteht ihr Fusionsprotein ?