Western Blot Analyse
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| Quelle: INVITROGEN- pRSET Manual |
Dem Insulin Gen vorgeschaltet befindet sich eine Sequenz, die für das "Xpress Epitope" kodiert. Für dieses Peptid gibt es spezielle Antikörper, mit denen unser Fusionsprotein detektiert werden kann. Wie dies funktioniert wollen wir uns im Folgenden genauer anschauen:
Beim Western Blot werden die zuvor elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulose Membran "geblottet", d.h. auf diese Membran transferiert. Dies geschieht durch Anlegen einen elektrischen Feldes. Die negativ geladenen Proteine wandern in diesem Feld zum + Pol (Anode).
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| Prinzip des Western Blottings |
Die Nitrozellulose Membran wird anschliessend mit einer Antikörperlösung behandelt. Die enthaltenen Antikörper erkennen spezifisch das Protein, das man untersuchen möchte.
Im Fall des Insulins gibt es bereits solche Antikörper. Gegen manch anderes, wenig erforschtes Protein müsste man einen solchen Antikörper erst herstellen. Dies kann einige Monate dauern.
Um jedes überexprimierte Protein mit Hilfe der Western Blot Methode untersuchen zu können, wird in Exressionsplasmiden wie pRSET meist ein detektierbares, und später abspaltbares Peptid an das entsprechende zu exprimierende Protein fusioniert. In unserem Fall das Xpress-Peptide (Epitope).
Die Nitrozellulose Membran wird somit mit einer Xpress Antikörper Lösung inkubiert. Während dieser Inkubation agiert der Xpress Antikörper als primärer Antikörper, der das Xpress Epitope erkennt. und somit an das Fusionsprotein auf der Membran bin. In mehrereren Waschschritten wird nicht-gebundener Antikörper anschliessend von der Membran entfernt. Nur der gebundene Antikörper bleibt fest mit dem Protein auf der Membran verbunden.
In einem zweiten Schritt gibt man nun einen zweiten Antikörper zu der Membran, der spezifisch an den ersten Antikörper bindet. Dieser Antikörper ist an ein Enzym gekoppelt, das eine chemisch-lumineszente Reaktion katalysiert. Nachdem der nicht gebundene Antikörper durch mehrere Waschschritte entfernt wurde, kann der Blot entwickelt werden. Hierzu gibt man ein spezielles Substrat auf die Membran. Überall dort, wo der zweite Antikörper gebunden hat, wird dieses Substrat in einer chemischen Reaktion umgesetzt, wobei ein Lichtsignal frei gesetzt wird. das man mit hoch sensitiven Geräten detektieren kann.
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| Quelle: www.leinco.com |
Western Blot Analyse
Western Blot Analyse