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1) Simply Science - Dossier DNA + Gentechnik

Lösungen

Lektion 1

• Gen
• Aminosäure
• Protein
• DNA
• Transkription
• mRNA
• Translation

Lektion 2



Aufgabe 1


A) Lewis Formel :          C6H12O6     

B) 

Monosaccharid, Hexose (C6),
Aldose (endständige Adehydgruppe)


C)

Aufgabe 2


A)  ATP


B) 

c) 
Glykolyse, Citrat-(Krebs-) Zyklus,  Oxidative Phosphorylierung

D) 6 Mol


E)  Das Mol (Einheitenzeichen: mol) ist die Basiseinheit der Stoffmenge. Sie dient der Mengenangabe bei chemischen Reaktionen.

Ein Mol enthält etwa 6,022 x 10²³ Teilchen. Diese Zahl ist so definiert, dass 12g des Kohlenstoff  Isotops C-12 genau einem Mol entsprechen. Somit enthält 1 Mol Glukose  6,022 x 10²³ Glukosemoleküle.

Das Molekulargewicht von Glukose (C6H12O6) beträgt   (6x12) + (12x1) + (6x16) = 72 +12 + 96 = 180 g/mol  

Somit wiegt 1 Mol Glukose 180 Gramm.

Aufgabe 3

 Lektion 3



Aufgabe 1

Autor: Sanger,F.

Titel: Chemistry of insulin; determination of the structure of insulin opens the way to greater understanding of life processes

Journal: Science (1959)

--> Frederick Sanger


Aufgabe 2

Insulin preproprotein [Homo sapiens] 
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGG GPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

- besteht aus 110 Aminosäuren
- die ersten 5 Aminosäuren kodieren für Methionin, Alanin, Lysin, Tryptophan, Methionin



Aufgabe 3

Lektion 4



Aufgabe 1

- Alpha Helix
- Beta Faltblatt

- Disulfidbrücken können nur Aminosäuren ausbilden, deren Säurerest Schwefel beinhaltet. Es gibt 2 Aminosäuren die Schwefel beinhalten: Methionin und Cystein

Lektion 5



Aufgabe 1

A)  

Ein Gen ist ein bestimmter Abschnitt auf der DNA, der für ein bestimmtes Protein bzw. Polypeptid (Ein-Gen-ein-Protein-Hypothese) oder ein für den Zellstoffwechsel benötigtes RNA-Molekül codiert.

B) 

A,T,G,und C stehen für die 4 Nukleotide. Ein Nukleotid ist ein Grundbaustein von Nukleinsäuren, also Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA). Es ist ein Molekül mit einem Phosphat-, einem Zucker- und einem Basen­bestandteil. Die Buchstaben stehen jeweils für die Nukleobasen Adenin (A), Thymin (T). Cytosin (C), Guanin (G) . Sie sind Bestandteile der Nukleotide.

C) 333 Baasenpaare (bp)

D) atg gcc ctg tgg atg cgc ctc ctg ccc ctg

E)  N-      M    A    L   W   M   R    L    L   P    L         -C

F)  Tatsächliche Sequenz:

      N-      M    A    L   W   M   R    L    L   P    L        -C

      Sequenz stimmt überein! 

Lektion 6



Aufgabe 1

Bakterien sind Prokaryoten. Hefen dagegen sind Eukaryoten.

Bakterien besitzen keinen Zellkern und auch keine typisch eukaryotischen Organellen wie das ER oder den Golgi Apparat.

Ist von einem Protein bekannt, dass es in einem speziellen Organell, z.B. dem ER oder aber dem Golgi Apparat, posttranslational modifiziert (z.B. glykosyliert, gefaltet oder gespalten) wird, sollte man ein eukaryotisches Expressionssystem (Hefen, Insektenzellen) vorziehen.

Aufgabe 2

Das Leader Peptid dient dazu, das translatierte Insulin in das endoplasmatische Retikulum zu schleusen, wo es weiter prozessiert wird. Da Bakterien kein ER besitzen, macht es auch keinen Sinn, dieses Signalpetid zu exprimieren.

Lektion 7




Aufgabe 1

Concept Map - Klonierung

Lektion 8



Aufgabe 1 + 2

Serial Cloner File -  Humanes Insulin, cds



Aufgabe 3

Serial Cloner File - Humanes Insulin, mRNA

Lektion 9



Aufgabe 1 + 3


Serial Cloner Cloner File -  pRSET A



Aufgabe 2

BamH I     
       

Sac I
Bgl II
Pst I
Pvu II
Kpn I
Nco I

BstB I
Hind III

Lektion 10

Aufgabe 2

• Template DNA  

        --> DNA Matrize

• Primer  (fwd. + rev. Primer   

      --> Startstücke für die DNA Polymerase

• dNTPs                

      --> DNA Bausteine

(Polymerase heftet dNMPs (Monophosphate) an den neu entstehenden DNA Strang, wobei Pyrophosphat (PPi) freigesetzt wird:  dNMP + PPi = dNTP )

• Polymerase Puffer   

      --> ideale Pufferbedingungen für die Polymerase (enthält z.B. Mg2+ Ionen  --> Cofaktor der Polymerase)

• DNA-Polymerase   

  --> Enzym, das das zum Nukleotid der Matrix komplementäre Nukleotid an den Primer bzw. die wachsene Kette anheftet und die Phosphodiesterbindung herstellt.

Aufgabe 3

Aufgabe 4

HIER können sie sich die Lösung als PDF herunterladen.

Mindestens 2 Zyklen sind erforderlich um mindestens 1 vollständiges Insert XhoI-Insulin-EcoRI zu erhalten (siehe Pfeile).

Lektion 11



Aufgabe 1


Serial Cloner File - PCR Produkt Insulin


Das PCR Produkt ist 281 bps lang.





GATCCTCGAGTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGC
AGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGGAATTCGAT










Nach dem Restriktionsverdau mit XhoI und EcoRI ist das Fragment 267 bp lang.

Lektion 12



Aufgabe 1

1) Absorptionsspektrum

Wird ein Atom oder Molekül mit weißem Lich (das alle Wellenlängen enthält) bestrahlt, so werden die Photonen absorbiert, d.h. die in den Photonen enthaltene Energie wird genutzt um  Elektronen in den Atomhüllen der bestrahlten Atome auf  energetisch höhere  Schalen anzuheben. Hierbei handelt es sich um scharf definierte Energiebeträge und damit Wellenlängen.  Licht dieser Wellenlängen wird beim Durchtritt durch das Atom somit aus der weißen Strahlung abgefangen (absorbiert), so dass es in dem Lichtspektrum, das die Probe durchstrahlt, anschliessend (zum Teil) fehlt. Seine Intensität nimmt ab. Ein Absorptionsspektrum zeigt, welche Wellenlängen am meisten "abgefangen", also absorbiert. werden. Fallen die angehobenen Elektronen auf eine energetisch niedrigere Schale zurück, wird die überflüssige Energie in Form von Licht abgegeben, man spricht dann von einem Emissionsspektrum. Die beobachteten Absorptions- und Emissionsspektren sind charakteristisch für die Art der Materie, die die Strahlung durchquert. Deshalb ist die Spektroskopie in verschiedenen Wellenlängenbereichen, auch mit ultraviolettem oder infrarotem Licht, eine wichtige Methode zur Analyse von Stoffen.

2) Bei Abbildung 2 handelt es sich um das Absorbtionsspektrum des Ethidiumbromids, das durch UV Licht (200nm-300nm) angeregt werden kann, d.h. in diesem Bereich hat es sein Absorptionsmaximum.

Aufgabe 2

Das PCR Produkt ist 281 bp lang. Deshalb sollte leicht unterhalb der Höhe der 300 bp Markerbande eine Bande auftauchen, die dem PCR Produkt entspricht.  Nicht eingebaute Primer und sich eventuell gebildetete Primerdimere sollten unterhalb der 100 bp Marke als Schmier zu erkennen sein. Da man in der PCR nur sehr wenig Template DNA (Matrize) einsetzt, ist diese aufgrund der zu geringen Konzentration auf dem Agarose Gel nicht zu sehen.

Lösung: Agarose-Gel des PCR Produktes

Aufgabe 3

Lösung Gelelektrophorese

Lektion 13




Aufgabe 1

Aufgabe 2

1 µl entspricht 10^-6 Litern (1 Millionstel Liter).

1 ml entspricht 10^-3 Litern (1 Tausendstel Liter).

Somit gilt:

1 µl   =  10^-3 ml (1 Tausendstel Mililiter)

Aufgabe 3

Wenn Sie anstatt des Vektors das Insert dephosphorylieren, wird hierdurch die Phosphatgruppe am 5´-Ende des Insert Fragmentes entfernt. Hierdurch kann keine Phosphodiesterbindung mehr mit dem Vektor geknüpft werden. Stattdessen führt die ausbleibende Dephosphorylierung des Vektors zu einer hohen Religationsfrequenz, die jedoch ausschliesslich in falschpositiven Transformanten resultieren wird. Durch dieses Malheur würde somit die ganze Klonierung scheitern.

Lektion 14



Serial Cloner File - pRSET-Insulin

Das Fusionsprotein besteht aus 125 Aminosäuren.

Lektion 17




Aufgabe 1 

IPTG muss man  250 fach verdünnen.
Kultur: V = 200 ml

200 ml/250 = 0,8 ml IPTG


Aufgabe 2 

Von der unverdünnten Probe 1 (vor Induktion) entnehmen sie 125 µl udn überführen diese in ein Reaktionsgefäss. Von der induzierten Probe 2 entnehmen sie 263 µl (direkt aus der Küvette, da sie ja auch diese gemessen haben) udn überführen diese ebenfalls in ein separates Reaktionsgefäss.  Tarieren sie beide Reaktionsgefäße durch Zugabe von Medium grob aus, damit es beim anschliessenden Zentrifugieren nicht zu Ungleichgewichten und damit einer Beschädigung der Zentrifuge kommt. Zentrifugieren sie die Zellen kurz (!) bei voller Geschwindigkeit (full speed)  ab (Nicht länger als 30 sec, sondern platzen die Zellen durch die hohe Zentrifugalkraft).

Kippen Sie den Überstand vollständig ab und resuspendieren Sie die Pellets in jeweils 20 µl Probenpuffer. Erhitzen Sie die Proben 5 Minuten bei 95°C.  In dem Probenpuffer sind SDS und ß-Mercaptoethanol enthalten. Diese entfalten die in der Probe enthaltenen Proteine und neutralisieren die Eigenladung der enthaltenen Proteine, so dass diese  bei der anschliessenden Elektrophorese nur nach Ihrer Größe aufgetrennt werden. Nach der Inkubation bei 95°C können die Proben auf ein SDS-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt werden.

Lektion 19

Isolierung des Fusionsproteins

Nachdem wir die optimalen Expressionsbedingungen (Temperatur, Induktionszeit) für unser Expressionssystem BL21/PRSET-Insulin bestimmt haben, können wir unter diesen Bedingungen eine Großkultur (z.B. 4x2 Liter) ansetzen und unter Zugabe von IPTG das Fusionsprotein exprimieren.

Aber wie können wir aus dem daraus gewonnenen Zelllysat anschliessend das Fusionsprotein in reiner Form isolieren?

Hier kommt uns ein weiteres Kriterium unseres Fusionsproteins zu Hilfe.

Durch das Einklonieren der Insulin Sequenz in den Expressionsvektor pRSETA kann das folgende Fusionsprotein exprimiert werden:

Insulin-Fusionsprotein

Dieser sogenannte His-Tag besteht aus einer Nukleotidsequenz, die für sechs Histidine kodiert. Diese Hididine können mit den positiv geladenen Ni-Ionen eines speziellen Säulenmaterials (Ni-NTA) interagieren und somit gebunden werden. Indem man das Lysat mit der Säulenmatrix inkubiert, kann das Fusionsprotein an das Säulenmaterial gebunden werden, während alle anderen Proteine ungebunden im Durchfluss verbleiben. Nach einigen Waschschritten kann somit das Fusionsprotein von allen übrigen Proteinen des Zelllysates getrennt werden. Von der Säule eluiert wird das Fusionsprotein anschliessend mit einem Elutionspuffer, der Imidazol enthält. Imidazol hat eine höhere Affinität zu dem Säulenmaterial und verdrängt dadurch das Fusionsprotein von der Säule.

Interaktion des His-Tags mit einer Ni-NTA Matrix.  Quelle: Chemgapedia

  

Quelle: Quiagen (modifiziert)

Lektion 18

Western Blot Analyse

Quelle: INVITROGEN- pRSET Manual

Dem Insulin Gen vorgeschaltet befindet sich eine Sequenz, die für das "Xpress Epitope" kodiert. Für dieses Peptid gibt es spezielle Antikörper, mit denen unser Fusionsprotein detektiert werden kann. Wie dies funktioniert wollen wir uns im Folgenden genauer anschauen:

Beim Western Blot werden die zuvor elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulose Membran "geblottet", d.h. auf diese Membran transferiert. Dies geschieht durch Anlegen einen elektrischen Feldes. Die negativ geladenen Proteine wandern in diesem Feld zum + Pol (Anode).

Prinzip des Western Blottings

Die Nitrozellulose Membran wird anschliessend mit einer Antikörperlösung behandelt. Die enthaltenen Antikörper erkennen spezifisch das Protein, das man untersuchen möchte. 

Im Fall des Insulins gibt es bereits solche Antikörper. Gegen manch anderes, wenig erforschtes Protein müsste man einen solchen Antikörper erst herstellen. Dies kann einige Monate dauern.

Um jedes überexprimierte Protein mit Hilfe der Western Blot Methode untersuchen zu können, wird in Exressionsplasmiden wie pRSET meist ein detektierbares, und später abspaltbares Peptid an das entsprechende zu exprimierende Protein fusioniert. In unserem Fall das Xpress-Peptide (Epitope).

Die Nitrozellulose Membran wird somit mit einer Xpress Antikörper Lösung inkubiert. Während dieser Inkubation agiert der Xpress Antikörper als primärer Antikörper, der das Xpress Epitope erkennt. und somit an das Fusionsprotein auf der Membran bin.  In mehrereren Waschschritten wird nicht-gebundener Antikörper anschliessend von der Membran entfernt. Nur der gebundene Antikörper bleibt fest mit dem Protein auf der Membran verbunden.

In einem zweiten Schritt gibt man nun einen zweiten Antikörper zu der Membran, der spezifisch an den ersten Antikörper bindet. Dieser Antikörper ist an ein Enzym gekoppelt, das eine chemisch-lumineszente Reaktion katalysiert. Nachdem der nicht gebundene Antikörper durch mehrere Waschschritte entfernt wurde, kann der Blot entwickelt werden. Hierzu gibt man ein spezielles Substrat auf die Membran. Überall dort, wo der zweite Antikörper gebunden hat, wird dieses Substrat in einer chemischen Reaktion umgesetzt, wobei ein Lichtsignal frei gesetzt wird. das man mit hoch sensitiven Geräten detektieren kann.

Quelle: www.leinco.com

Western Blot Analyse










Western Blot Analyse

Lektion 17

Proteinexpression

 

Inkubierende Bakterienkulturen (Quelle https://superfund.pharmacy.arizona.edu)

Um die Konzentration einer Bakterienkultur (d.h. die Menge der darin enthaltenen Zellen) zu messen, macht man sich eine physikalische Eigenschaft der Bakterien in Lösung zu nutze. Aufgrund ihrer sehr kleinen Größe (1-2 µm) verhalten sich Bakterienzellen in Lösung wie kleine Partikel, an deren Oberfläche langwelliges Licht gebrochen wird. Wenn man die Zellen mit einem Lichtstrahl definierter Wellenlänge (meist 578 nm) anstrahlt, wird das Licht an den Bakterien gebrochen, wodurch es nicht mehr gänzlich den Detektor erreicht. Es kommt zu einer Abnahme der Lichtintensität, die durch die Probe hindurch geht. Diese sogenannte Extinktion kann man in einem Photometer messen. Sie ein Mass für die Konzentration der Bakterienkultur.

Optische Dichte


Im Bereich 0-0,5 ist die optische Dichte linear, d.h. aus ihrem Wert kann auf die Bakterienzahl in der Kultur geschlossen werden. Zeigt die optische Dichte einen höheren Wert als 0,5 an, muss man die Probe verdünnen und erneut messen, um einen verlässlichen Wert zu bekommen.


Gewöhnlich impft man einen Tag vor der geplanten Proteinexpression eine kleine Übernachtkultur mit einer Bakterienkolonie an und lässt diese Kultur über Nacht bei 37°C auf einem Schüttler wachsen. Durch das Schütteln wird die Kultur kontinuierlich gemischt (Zellen setzen sich nicht ab) und sie wird dadurch mit Sauerstoff versorgt. Am nächsten Tag impft man eine grössere Expressionskultur mit einer recht niedrigen Konzentration (OD578 = 0,2) an und lässt sie bei 37°C auf einem Schüttler bis zu einer OD578 von 0,5 bis 0,8 anwachsen. In dieser Zeit vermehren sich die Bakterienzellen und treten aus der sogenannten Lag-Phase in die Log-Phase. Bei einer OD578= 0,5 - 0,8 gibt man anschliessend 1mM IPTG zu der Kultur. Hierdurch wird die Repression der T7 Polymerase aufgehoben. Das rekombinante Protein (in unserem Fall das Insulinfusionsprotein) kann transkribiert (und translatiert) werden. Die Dauer einer Proteinexpression muss jedoch für jedes individuelle Protein angepasst werden. Während man bei manchen Proteinen die optimale Ausbeute bereits nach einer Stunde erhält, müssen andere Proteine länger exprimiert werden, um eine optimale Ausbeute zu erreichen.
 

Wachstumskurve einer Bakterienkultur  (Quelle: Wikipedia)

Aber wie kann man nun überprüfen, ob zum Zeitpunkt X viel oder wenig rekombinantes Protein produziert wurde?

Hierzu gibt es zwei Möglichkeiten: 

Eine schnelle aber weniger genaue Methode und eine zeitaufwendige Methode, die dafür aber hoch sensitiv und genau ist. Beide Methoden basieren auf einer der wichtigsten Methoden der Biochemie:

Die SDS Gelelektrophorese

Die SDS Gelelektrophorese ist eine Methode, mit deren Hilfe man Proteine elektrophoretisch auftrennen kann.

Hierzu gibt man mind. 0.1 % SDS zu der Proteinlösung. SDS erfüllt hierbei zwei wichtige Funktionen: Zum einen werden gefaltete Proteine denaturiert, so dass sie als lineare Polypeptidketten vorlegen. Zum Anderen ist SDS negativ geladen und bindet sehr effizient an das Protein. Hierdurch wird die Eigenladung des Proteins aufgehoben und alle Proteine werden negativ geladen. Hierdurch wird gewährleistet, dass beim Anlegen einer elektrischen Spannung die Proteine lediglich aufgrund ihrer Größe, nicht aber aufgrund ihrer Eigenladung zur Anode (+ Pol) wandern.

Während man für DNA und RNA Proben Agarose für die Matrix verwendet, wird für die Auftrennung von Proteinen ein Polyacrylamidgel aus Acrylamid und Bisacrylamid angefertigt. Acrylamid und Bisacrylamid sind im flüssigen Zustand sehr giftig (neurotoxisch, kann durch die Haut aufgenommen werden). Deshalb muss man bei der Anfertigung eines solches Gels immer Schutzkleidung und Handschuhe tragen. In Anwesenheit eines Radikals wird eine Polymerisation der Komponenten gestartet, die zur Ausbildung eines netzartigen Polymers führt. Die Porengröße ist dabei abhängig von der Konzentration der Komponenten. Die Polymerisation wird durch Radikale initiiert, die durch den chemischen Zerfall von Ammoniumpersulfat (APS) entstehen. Diese Radikale werden durch den Zusatz von Temed stabilisiert. 

Polymerisation des Polyacrylgels (Quelle:  www.bio-rad.com/LifeScience/.../Bulletin_1156.pdf (modifiziert))

Bei der anschliessenden Gelelektrophorese können sich kleinere Proteine besser und damit schneller durch die Poren bewegen als größere Proteine, wodurch es zu einer Auftrennung unterschiedlich großer Proteine kommt.

Chemgapedia - SDS Gelelektrophorese

Um nach Zugabe eines Inducers die Proteinexpression in der Bakterienkultur zu überprüfen, nimmt man jeweils ein Aliquot (ca. 50 µl) sowohl der induzierten Bakterienkultur als auch ein Aliquot nicht-induzierter Bakterienzellen (Entnahme vor der Induktion).  Mit Hilfe eines Spektrometers misst man nun die optische Dichte der jeweiligen Bakterienkultur (Verdünnung erstellen) und stellt die Probe auf die gleiche OD ein. Das jeweilige Zellvolumen wird kurz abzentrifugiert und in einem definierten Volumen SDS Probenpuffer resuspendiert. Die Proben werden 5 min bei 90°C gekocht. Durch die Hitze sowie die Komponenten im Probenpuffer (SDS, ß-Me), werden die Zellen aufgebrochen, die Proteine denaturiert und durch das SDS negativ geladen. Nun werden 20µl jeder Probe auf ein SDS-Gel aufgetragen udn elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Beendigung des Gellaufs wird das Gel in Coomassie Lösung gefärbt und anschliessend entfärbt. Coomassie-Blau ist ein Farbstoff, der mit Proteinen wechselwirkt udn diese Blau färbt. Durch das Entfärben werden alle nicht gebundenen blauen Farbmoleküle aus dem Gel entfernt, sodass nur noch die jeweiligen Proteinbanden zu sehen sind:

In diesem Bild einer Beispielexpression sehen sie, dass nach IPTG Induktion bei 32,5 kDa eine Bande auftaucht, die vor der Induktion noch nicht zu sehen war. Dies ist das überexprimierte Protein.

Aufgabe 1

Sie haben eine 200 ml Bakterienkultur, die sie nun mit 1mM IPTG induzieren möchten. Ihre Stammlösung IPTG hat eine Konzentration von 250 mM.

Wieviel dieser Stammlösung müssen Sie zu der Bakterienkultur geben um eine Konzentration von 1mM IPTG zu erhalten? 

Aufgabe 2




Sie führen eine Proteinexpression des Insulin-Fusionsproteins durch. Hierzu haben sie eine 100 ml Bakterienkultur mit einer Übernachtkultur  (BL21-pRSETA-Insulin) auf eine OD578 = 0,2 angeimpft und bis zu einer OD578 = 0,8 wachsen lassen. Bei Erreichen der OD578 = 0,8 entnehmen sie ein Aliquot (vor Induktion) und induzieren die restliche Kultur mit 1mM IPTG. Nach 4h möchten sie die Expression des Insulin Fusionsproteins mittels SDS-Gelelektrophorese testen. Hierzu entnehmen sie ein weiteres Aliquot (nach Induktion). Von beiden Proben messen sie die OD578. Probe 1 zeigt eine OD578 von 0,8 (vor Induktion), Probe 2 (nach Induktion) zeigt eine eine OD578 von 1,4. Während man bei OD578 = 0,8 die Linearität der Konzentration zur Absorption gerade noch vernachlässigen und diesen Wert nehmen kann, liegt der Wert der zweiten Probe (nach Induktion) bei weitem nicht mehr im linearen Bereich. Diese Probe verdünnen sie nun im Verhältnis 1:4 und messen erneut. Die OD578 beträgt nun 0,38 (1:4 Verdünnung in 1 ml).

Sie wollen auf das Polyacrylamidgel jeweils eine OD578 von 0,1 auftragen. Hierzu müssen sie das entsprechende Volumen der jeweiligen Zellsuspension ausrechnen, die darin enthaltenen Zellen abzentrifugieren und in Probenpuffer aufnehmen. Berechnen sie das jeweilige Volumen der Zellsuspension, das einer OD578 = 0,1  entspricht.